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Western-blotting蛋白萃取方法及注意事項在實驗過程中,我們常常需要藉由萃取細胞組織中的蛋白質,來觀察蛋白質表現量的變化。樣品蛋白質萃取品質的好壞非常重要, ...
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Western-blotting
蛋白萃取方法及注意事項
在實驗過程中,我們常常需要藉由萃取細胞組織中的蛋白質,來觀察蛋白質表現量的變化。樣品蛋白質萃取品質的好壞非常重要,對實驗結果影響甚大,因此以下介紹蛋白質萃取方法及注意事項:
蛋白質樣品製備原則
實驗前要先充分了解實驗目的,根據實驗、分析的蛋白質,再決定如何進行樣本前處理,找出最適合的實驗方法。原則盡可能去除非蛋白質的物質,保留蛋白質,
保留蛋白質: 維持低溫處理、添加蛋白酶抑制劑可減少蛋白質降解。 去除核酸、多糖和脂類等可能產生干擾的大分子物質。 依實驗目的選擇蛋白質裂解液
蛋白質裂解液(Lysis Buffer)常見成份
蛋白質裂解液(Lysis Buffer) 的基本組成為: pH緩衝液 (pH Buffer)、離液劑(chaotropes)、表面活性劑(sufactants/detergents)、鹽類、還原劑(reducing agent)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor) 以及磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)。常見的蛋白質裂解液配方:ACE Biolabs 1X RIPA Lysis Buffer (C1020)[1] 25 mM Tris-HCl pH7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS,絕大多數細胞或動物組織樣品皆可以此配方為基底,依照實驗目的添加離液劑、介面活性劑、還原劑、蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑,或調整其濃度。
離液劑(chaotropes):也稱為變性劑,可以破壞氫鍵等次級鍵,增加蛋白質的溶解性。代表試劑為尿素(Urea)及硫脲(thio...(1) 蛋白質的萃取 | 油脂營養成分查詢網
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